Espectrometria de massas para iniciantes

De Eduardo César Meurer

O livro Espectrometria de Massas para Iniciantes lança mão de uma linguagem simples sobre essa técnica que trafega em diversas áreas das Ciências Exatas, Biológicas e da Terra. Tal técnica teve, desde sua concepção com Thomson, diversos ganhadores de Prêmios Nobel e representa hoje uma das formas mais assertivas de investigação do mundo molecular microscópico por meio do estudo das propriedades das espécies químicas nos mais diversos ambientes ou matrizes. A partir dessa técnica, diagnósticos estão se tornando mais eficientes, sistemas biológicos complexos são explorados rapidamente, e compostos tanto perniciosos como a favor da vida podem ser avaliados de forma robusta e consistente. Para utilizar a técnica ou desenvolver algo novo dentro da área de instrumentação, este livro vai ajudar a leitora ou o leitor a ter uma boa ideia do que a Espectrometria de Massas pode proporcionar no campo científico. Claro que a leitura de artigos fundamentais citados no texto e exercícios propostos aprofundarão mais ainda a experiência nessa técnica analítica. Porém, mesmo sabendo tudo o que consta neste livro, você, leitor, continuará, como eu, um mero iniciante nas artes da espectrometria de massas, pois esta é muito abrangente, e seus aspectos, muito amplos. Mas tenho certeza de que será uma leitura agradável para químicos, físicos, biólogos, farmacêuticos, médicos, engenheiros ou qualquer profissional que deseja se aventurar neste estado da arte das análises moleculares.

• Idioma: Português
• Editora: Editora Appris
• Data de lançamento: 9 de jun. de 2020
• ISBN: 9786586034356

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COMITÊ CIENTÍFICO DA COLEÇÃO ENSINO DE CIÊNCIAS

Aos meus pais, esposa e filhos,

por todo amor e cuidados a mim dispensados.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu grande mentor e incentivador, Prof. Dr. Marcos Eberlin, ao meu irmão científico e amigo Prof. Dr. Luiz Alberto Beraldo de Moraes, pelas grandes ideias e discussões, ao meu irmão científico Prof. Dr. Fabio Gozzo, pelas grandes discussões na época de mestrado e doutorado, à minha colega de trabalho e amiga Prof.ª Valquíria de Moraes Silva, pelo incentivo, e ao meu amigo Dr. Marcos Alessandro Ribeiro, pelas discussões e aprendizados e pelo incentivo.

Vocês impulsionam meu crescimento.

Sumário

1

Introdução 13

1.1. Visão Geral 13

Exercício desafio: Adicione outras aplicações até completar 15 itens. 14

1.2. História – De Fenn a Thomson, uma volta ao passado 17

1.2.1. Linha do Tempo da Espectrometria de Massas 19

1.3. Fundamentos 30

1.3.1. Conceitos de Química Geral em Espectrometria de Massas 30

1.3.1.1. Conceito de Massa dos átomos 30

1.3.1.2. Conceito de Ligações Químicas 31

1.3.1.3. Conceito Ácido-Base 32

1.3.2. Conceitos de Física em Espectrometria de Massas 32

1.3.3. Química Orgânica em Espectrometria de Massas 33

1.3.4. Espectrometria de Massas 33

1.3.5. Isótopos 34

1.3.6. Espectro de Massas e Fragmentação 38

1.3.7. Aquisição de espectros de massas 40

1.3.8. Parâmetros Analíticos em Espectrometria de Massas 41

1.3.8.1. Sensibilidade 41

1.3.8.2. Resolução 42

1.3.8.3. Exatidão de Massas 43

1.3.8.4. Defeitos de Massas 43

1.3.8.5. Curva de Calibração 46

1.3.8.6. Repetibilidade/Reprodutibilidade 48

1.3.8.7. Intervalo Dinâmico 49

2

Fontes de Ionização 51

2.1. Fonte de Ionização por Elétrons (Electron Ionization, EI) 52

2.2. Fonte de Ionização por Eletrospray (Electrospray Ionization, ESI) 58

Cálculo da Massa de uma proteína por ESI 59

2.3. Fonte de Ionização Química à Pressão Atmosférica (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) 68

2.4. Fonte de Fotoionização Química à Pressão Atmosférica (Atmospheric Pressure Photochemical Ionization, APPI) 70

2.5. Fonte de Ionização por Laser Assistida por Matriz (Matrix Assisted Lazer Desoption Ionization, MALDI)  73

2.6. Fontes de Ionização Ambiente 74

3

Analisadores de Massas 79

3.1. Analisador Quadrupolar 82

3.2. Analisador Ion-trap 91

3.2.1 Ion-trap tridimensional 92

3.3. Analisador por Tempo de Voo (Time of Flight, TOF) 93

3.4. Analisador Orbitrap 94

3.5. Analisador por Ressonância Ciclotrônica de Íons com transformada de Fourier (FT ICR-MS) 95

4

Interpretação de Espectros de Massas 99

4.1. Espectro de Massas 99

4.2. Passo a Passo da Interpretação de Espectros de Massas 101

4.3. Determinação de fórmula molecular 106

4.4. Mecanismos de Dissociação 111

) 113

4.4.2. Clivagem Indutiva (i) 114

), homolítica (h) e remota à carga (cr) 115

4.5. Rearranjo de Hidrogênio 116

4.6. Sítio de ionização 117

4.7 Regra do elétron par 120

4.8 Estudo de Casos 123

5

Cromatografia acoplada à Espectrometria de Massas 131

5.1. Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrômetro de Massas 131

5.2. Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-MS) 140

5.2.1. Fundamentos de Cromatografia Líquida 142

5.2.2. Moléculas que podem ser analisadas por LC-MS 148

5.2.3. Tipos de Cromatografia Líquida para Espectrometria de Massas 149

5.2.4. Preparo de Amostras para LC-MS 150

5.2.4.1. Precipitação de matriz 151

5.2.4.2. Extração Líquido-Líquido 151

5.2.4.3. Extração na fase Sólida 152

5.2.5. Espectrometria de Massas para cromatografia líquida 154

5.2.5.1. Metaboloma por LC-MS  155

5.2.5.2. Proteoma por nanoLC-nanoESI-MS  155

5.2.5.3. Quantificação de moléculas pequenas por LC-MS/MS  157

REFERÊNCIAS 159

índice remissivo 163

1

Introdução

1.1. Visão Geral

Desde os primórdios da química, buscamos técnicas analíticas que dão suporte a nossos sentidos humanos para diferenciar e analisar moléculas. Nossos sentidos básicos nos tornam aptos a nos relacionar com ambientes macroscópicos e interagir de forma sinérgica identificando objetos ao nosso redor. O sentido do olfato permite diferenciar moléculas pelo seu odor, a visão permite observar aspectos macroscópicos dos objetos como a cor, porém, quando queremos entender a constituição microscópica, precisamos de instrumentação para auxiliar nossos sentidos, como por exemplo, o microscópio. Porém moléculas têm dimensões nanométricas que não são facilmente analisadas por aparelhos como os microscópios simples, daí se fazem necessárias técnicas analíticas avançadas que auxiliam os sentidos na identificação e quantificação destas.

Estudando a etimologia do termo espectrometria, espectro é um substantivo masculino com o significado relacionado com a suposta aparição de um defunto, incorpórea, mas com sua aparência, isto é, um fantasma, ou seja, as informações acerca de uma forma ou vulto que nos remete à identificação de uma pessoa já falecida. Inicialmente, talvez seja difícil ligar a ideia de fantasma a uma técnica analítica, como a Espectrometria de Massas. Porém podemos utilizar a comparação entre espectro (fantasma) com espectrometria da técnica analítica de Espectrometria de Massas e relacionar informações não mais de forma, como em um fantasma, mas informações físicas, como das massas dos átomos ligados em uma molécula que nos remete a uma molécula.

Portanto, podemos entender que espectrometria significa a medida de algo (informações físicas) que nos remete a uma molécula, assim como um espectro nos remete a algo (um vulto ou forma) que nos faz lembrar uma pessoa, então, em Espectrometria de Massas, as informações de massas das moléculas que nos levam à sua estrutura molecular.

Espectrometria de massas é um termo utilizado para definir uma técnica analítica que nos dá informações por meio de medidas apresentadas em um gráfico (mais especificamente, espectro de massas), na maioria das vezes, em duas dimensões (x(m/z):y(Intensidade relativa%)) que remetem a aspectos estruturais e analíticos de moléculas orgânicas a partir das massas das substância ou fragmentos iônicos e abundâncias.

Podemos enumerar uma porção de tipos de análises em que a espectrometria de massas entra com uma contribuição significativa no mundo da ciência, como:

Determinação estrutural de moléculas orgânicas em conjunto com Ressonância Magnética Nuclear e Infravermelho.

Análise de petróleo e seus derivados.

Análise de pesticidas e herbicidas em solo, água e ar.

Teste antidoping de atletas.

Testes toxicológicos de profissionais.

Estudo de farmacocinética em animais e humanos.

Estudo de degradação de fármacos.

Imagem química de superfícies de tecidos biológicos.

Exercício desafio: Adicione outras aplicações até completar 15 itens

Exercício 1: o que é Espectrometria de Massas, e como é apresentado o resultado de uma medida por essa técnica?

A espectrometria de massas (MS, mass spectrometry) é, nos dias de hoje, reconhecidamente uma das técnicas instrumentais mais úteis e poderosas em investigações científicas e com ampla aplicação em várias áreas da ciência, e entre as mais importantes se encontram a física, a química, ciências biológicas e a medicina. A vasta aplicabilidade da MS decorre da grande variedade de suas técnicas de formação de íons, como ionização por elétrons (EI, Eléctron Ionization), ionização química (CI, Chemical Ionization), ionização por Eletrospray (ESI, Electrospray Ionization), ionização química à pressão atmosférica (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization), ionização fotoquímica à pressão atmosférica (APPI, Atmospheric Pressure Photochemical Ionization), ionização a laser assistida por matriz (MALDI, Matrix Assisted Lazer Dessorption Ionization) e ionização ambiente, e, entre elas, ionização por dessorção com eletrospray (DESI, Desorption Electrospray Ionization) e ionização por dessorção por spray ambiente (EASI, Easy Ambient Spray Ionization) etc.; e de suas técnicas de análises de razões massa/carga (m/z) como analisadores quadrupolares (Q, Quadrupole), armazenadores de íons (IT, Ion-trap), tempo de voo (ToF, time-of-flight); e sistemas de detecção, como multiplicadores de elétrons. Cada módulo destes (ionização, análise e detecção, Figura 1) pode ser combinado de diversas maneiras, gerando várias configurações de espectrômetros de massas (EI-Q, ESI-QqQ, MALDI-Tof etc.). A MS tem se beneficiado também do desenvolvimento cada vez maior da eletrônica, alcançando grande agilidade na aquisição de dados uni-, bi- e tridimensionais, tornando as análises mais rápidas, sensíveis e seletivas, além de se beneficiar do desenvolvimento de novos programas de computador, mostrando ferramentas que agilizam a interpretação de grandes volumes de dados.

Figura 1 – Espectrômetros de Massas, a) com fonte de ionização sob vácuo e b) com fonte de ionização à pressão atmosférica

Fonte: autor

As aplicações de MS abrangem áreas muito distintas, tão diferentes quanto, por exemplo, a paleontologia, a geologia do petróleo e seus biomarcadores, os produtos naturais, a análise de proteínas (proteôma), análise de metabólitos (metabolôma), os estudos fundamentais como mecanismos de processos catalíticos orgânicos